GAL4-DAX-1 융합을 발현하는 플라스미드는 마우스 DAX-1(aa 247-472)을 함유하고, GAD-RIP 140 융합을 표현하는 플라스미드는 인간 RIP 140(aa 1-1158)을 함유하였다. GAL4 기반 효모 2-하이브리드 시스템은 SF-1과 상호 작용하는 단백질을 식별하기 위해 사용되었다. 소 SF-1 aa 115-461을 함유하는 GAL4-SF-1 융합을 발현하는 벡터를 효모 균주 CG-1945에서 인간 고환 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는데 사용되었다. 핵인자 RIP 140(aa 525-1158)을 분리하였다. 플라스미드 GAD-RIP 140(aa 1-1158)이 시공되었고, GAL4-SF-1과의 상호작용을 조사하였다. 동면역침전은 앞서 설명한 바와 같이 시험관내 번역단백질(29)을 사용하여 수행하였다. pBK SF-1 플라스미드는 TNT T7 결합 망상 리세이트 시스템(Promega Corp.)에서 방사성 라벨이 부착된 SF-1을 생성하는 데 사용되었습니다. (29). 35S 표지된 SF-1을 재조합 인간 DAX-1로 배양하였다. RIP 140 단백질은 앞서 설명한 T7 RNA 폴리머라제 기반 TNT 결합 망상 리액질 용해 시스템을 사용하여 시험관 내에서 합성하였다(Promega Corp.). 35S 표지된 RIP 140은 재조합 GST-SF-1 또는 재조합 인간 DAX-1로 배양하였다. 인간 DAX-1 단백질은 공급업체 매뉴얼의 지침에 따라 박테리아로 발현되었다(노바겐, 샌디에이고, 캘리포니아).

반응 혼합물을 결합 완충액으로 희석(20 mm HEPES, 5% 글리세롤, 100 mm KCl, 5 mm MgCl2, 0.5 mm 디티오트레이톨, 및 1 mm EDTA, 최종 부피 25 μl) 및 가교 가능한 가교제(5 mm 디티오비스[succinimidyl propionate])를 25C에서 1시간 동안 25°C로 담금기 후, 22m로 담금질한다. Radioimmunocipitation는 500 μl RIPA 완충액(PBS, 1% 노니데트 P-40, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 10 mg/ml 페닐메틸설포닐플루오라이드, 30 μg/ml 아프로티닌, 및 10 μg/나트륨 또는 나트륨 10μl을 첨가하여 수행하였다) 4C에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 20°C의 단백질 G-세파로즈 4FF(Amersham Pharmacia Biotech)를 첨가하고, 혼합물을 4C에서 1시간 동안 배양하였다. 바운드 복합체는 2 m 우레아를 함유하는 RIPA 완충체로 4회 세척되었다. 침전된 단백질을 20 μl 2 × SDS 샘플 버퍼로 용출하여 교차 링크를 반전시키고, 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 해결되고, 건조시키고, 자가방사선에 의해 가시화하였다. 저자는 제롬 F. 스트라우스 III 박사에게 감사 (펜실베니아 대학, 필라델피아, 펜실베이니아) 이 원고의 그의 비판적 독서에 대한. DAX-1과 RIP 140 사이의 상호 작용을 확인하기 위해 또는 스테로이드 호르몬 생산 세포에서 DAX-1과 SF-1 사이의 상호 작용을 확인하기 위해, 전체 세포 추출물을 이용한 공동면역침전을 수행하였다(도 6). 마우스 Y-1 세포 또는 인간 과립박증 유사 종양 세포로부터의 전체 세포 추출물을, KGN 세포는, GST-SF-1 또는 그의 태그가 붙은 인간 DAX-1 재조합 단백질로 배양하였다. 단백질 복합체는 글루타티온-세파로즈-4B 또는 히-바인드 수지로 침전되었다.

단백질 복합체는 DAX-1 항체 또는 RIP 140 항체를 사용하여 서양 얼룩에서 분석되었다. 도 6A에 도시된 바와 같이, DAX-1 항체는 Y-1 세포 및 SKG 세포(레인 1 및 4)에서 55 kDa에서 특정 대역을 검출하였다. DAX-1 단백질은 Y-1 세포와 KGN 세포 모두에서 GST-SF-1 융합 단백질에 의해 침전되었다(레인 3 및 6). 이 응축 결과 제시 DAX-1-상호 작용 SF-1 스테로이드 호르몬 생산 세포에. RIP 140 항체는 도 6B(레인 1 및 6)에서 Y-1 세포 및 KGN 세포에서 140 kDa를 검출하였다. RIP 140 단백질은 GST-SF-1 융합 단백질(레인 3 및 7) 및 그의 태그가 지정된 DAX-1 융합 단백질(레인 5 및 10)에 의해 침전되었다. 침전 결과는 RIP 140이 DAX-1과 상호 작용하고 RIP 140이 스테로이드 생산 세포에서 SF-1과 상호 작용한다는 것을 보여주었습니다.

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